آموزش وردپرس

تخلیص DNA Extraction )DNA )

به طور کلی برای انجام یک واکنش PCR خوب نیاز به استخراج یا تخلیص DNA داریم ; در واقع PCR واکنش زنجیره ای پلیمراز است که برای تکثیر یک ناحیه ی ژنتیکی مشخص در یک عامل بیولوژیک خاص که توسط  پرایمر اختصاصی شناسایی می شود به کار میرود .

روش کلاسیک استخراج DNA

ابتدا کلیات مراحل این روش را ذکر میکنیم سپس طبق پروتکل مراحل را انجام میدهیم .

مرحله اول : تهیه ی هموژن سلولی ( homogenization)

یعنی تهیه ی یک سوسپانسیون سلولی که میخواهیم DNA آنها را جداسازی کنیم که با توجه به نمونه ی مورد استفاده ، تهیه ی هموژن متفاوت است ،

مثلا در نمونه بافت : باید بافت را بکوبیم و تجزیه کنیم  و سلول هایش را جدا کنیم

در نمونه خون : جداسازی سلول های هسته دار ؛  برای جداسازی نوتروفیل > استفاده از بافی کوت

برای جداسازی  مونوسیت و لنفوسیت > استفاده از فای کول

همچنین محتوی DNA داخل غشاها و هسته قرار گرفته و برای لیز غشا ها  استفاده از :

1: محلول هیپو تونیک ( مثل آب مقطر ) > سبب پاره شدن غشاء سلول میشود

2: دترجنت یا شوینده (مثل SDS سدیم دو دسیل سولفات ) که با پایین اوردن کشش سطحی ،غشا سلول و هسته را پاره میکند .این ترکیبات بافر لیز کننده هستند که فاز ابی دارند .

مرحله دوم : جداسازی یا حذف سایر مواد موجود در سلول ( پروتئین و لیپید و مواد دیگر)

برای این کار از فنول و کلروفرم و ایزو امیل الکل استفاده میشود که فنل و کلروفرم سبب رسوب pro   میشود  و ایزوآمیل الکل کف حاصل از فنل و کلروفرم را کم کرده و کمک به تفکیک بهتر فاز آبی و فاز آلی میکند. همچنین به عنوان جایگزین میتوان از آنزیم پروتئیناز k استفاده کرد که سبب تجزیه پروتئین می شود.

پس از افزودن این ترکیبات آلی به داخل میکروتیوب ، سانتریفیوژ انجام می شود ، بعد از سانتریفیوژ ، دو فاز کاملا جدا شده داخل میکروتیوب وجود دارد ،

قسمت بالایی میکروتیوب فاز آبی شامل DNA و RNA سلولی است و قسمت زیرین میکروتیوب فاز آلی وجود دارد بین این دو لایه یک خط سفید جدا کننده وجود دارد که پروتئین های دناتوره شده هستند.

مرحله سوم :تغلیظ  DNA

در این مرحله باید DNA  را رسوب داد که از نمک استفاده می شود این نمک پیوند های هیدروژنی بین آب و DNA را بهم می زند و باعث رسوب آن می شود و سپس از اتانول سرد 70% استفاده میکنیم.

نکته: ضربات مکانیکی شدید سبب شکسته شدن DNA میشود !

مرحله چهارم : اندازه گیری DNA

استفاده از اسپکتروفتومتری > اندازه گیری جذب نوری در طول موج 260nm

نکته 1: که اگر مقدار آن برابر یک شود یعنی 50 میکروگرم DNA داریم

نکته 2: برای ارزیابی خلوص DNA  میتوان از نسبت جذب نوری در 260/280 استفاده کرد به طوری که اگر حاصل برابر یا بزرگتر از1.8 باشد > خلوص خوبی دارد، کمتر از آن نشان دهنده وجود پروتئین بیشتر در محلول است.

روش تجاری : از روش های دیگر تخلیص سازی است و راحت تر است

در اصل  یک کروماتو گرافی تعویض یونی است که در آن از ستون های کروماتوگرافی برای  تخلیص DNA بر اساس بار منفی آنها استفاده می کنند و درون این ستون ها ژل کروماتو گرافیanion exchanger که دارای بار  مثبت بالایی هستند وجود دارد.

معمولا با استفاده از بافرهایی که کیت در اختیار میگذارد ، هموژن میسازیم و روی ستون ها میریزیم و با بافر شست و شو میدهیم تا تمام محلول ها و pro و مولکول هایی که بار منفی ندارند از ستون خارج شوند و فقط DNA متصل به ستون باقی می ماند .

در مرحله بعد با اضافه کردن محلول نمکی غلیظ  > DNA را جمع اوری میکنیم .

در حین انجام این روش ها باید توجه داشت از EDTA  به جای هپارین در مراحل خونگیری و extraction استفاده کرد زیرا یون هایی که  باعث فعالیت انزیم های DNAase میشود را حذف میکند و مانع لیز DNA میشود.



 

در ادامه طبق پروتکل مراحل را انجام میدهیم:

1) 5ml خون به داخل ويال محتوي محلول EDTA نيم مولار ( 10%) ميريزيم و خوب مخلوط ميكنيم
سپس سانتريفيوژ كرده و لايه بافي كوت را جدا نموده و به يك لوله ديگر انتقال داده

٢) ٢٠٠ ميكروليتر از بافي كوت را به ميكروتيوب ١/٥ ميلي ليتري انتقال می دهیم

٣) ١ ميلي ليتر اب مقطر اضافه و ورتكس كنيد
٤) به مدت ٣ دقيقه در دور ٨٠٠٠ سانتريفيوژ كرده و سوپرناتانت را دور بريزيد
٥) مراحل ٣و ٤ را تكرار كنيد

٦)به رسوب سفيد ، ٠/٥ ميلي ليتر بافر TES اضافه و ورتكس كرده

٧) ٢٠ ميكروليتر SDS ١٠٪ به علاوه ٢٥ ميكروليتر پروتئيناز k اضافه و ورتكس كنيد

٨) محلول را ١٠ دقيقه در بن ماري ٧٠ درجه بگذاريد

IMAG2622[1]

٩) ٢٢٠ ميكروليتر محلول كلريد سديم ٦ مولار اضافه و ورتكس كنيد

١٠ ) به مدت ٥ دقيقه در ١٣٠٠٠ دورسانتريفيوژ كرده ، سوپوناتانت حاوي DNA است

IMAG2619[1]

١١) ٠/٥ ميلي ليتر سوپرناتانت را به لوله جديد ریخته و ٥٥٠ ميكروليتر ايزوپروپانول اضافه كرده و به ارامي مخلوط كنيد تا كلافDNA تشكيل شود

dna

١٢) بمدت ١ دقيقه با دور ٩٠٠٠ سانتريفيوژ كرده

١٣) سوپرناتانت را دور ريخته و به رسوب ، اتانول سرد ٧٠٪ اضافه كرده و مدت ١ دقيقه در ٩٠٠٠ دور سانتريفيوژ كنيد

١٤) مايع رويي را دور ريخته و بگذاريد در حرارت محيط رسوب خشك شود

IMAG2625[1]

١٥) رسوب DNA را در ١٠٠ ميكروليتر محلول TE حل كنيد

16)مقدار ٥ ميكروليتر از اين محلول را به ٩٥ ميكروليتر اب مقطر اضافه كرده

١٧) OD محلول را در طول موج ٢٦٠ و ٢٨٠ قرائت كنيد

١٨) نسبت OD ٢٦٠ به ٢٨٠ نانومتر را حساب كنيد

در این نوشته قسمت هایی از biotechnology91.blogfa.com برداشت شده است.

این نوشته ممکن است دارای نواقص علمی و یا نوشتاری باشد ، لذا نویسنده , سایت با تاکید بر این نکته ، هیچ مسئولیتی در ارتباط با اعتبار این مطلب ندارد.

14 like
Print Friendly, PDF & Email

درباره ی مهرنوش ادیب

مهرنوش ادیب
نویسنده بخش ویروس شناسی پزشکی نویسنده بخش پاتولوژی

سوال یا نظری دارید؟ بنوبسید

24 نظر در مورد "تخلیص DNA Extraction )DNA )"

avatar
  Subscribe  
newest oldest most voted
Notify of
نفس
Guest

سلام…خسته نباشید.استخراج دی ان ای با کیت وستون سیلیکونی چجوریه؟

سامان
Guest

بسیار عالی و کامل…متشکرم

mahbobeh
Guest

سلام.طرز تهیه محلول TES میخواستم
با تشکر

روابط عمومی
Member

با سلام و آرزوی قبولی طاعات و عبادات شما دوست عزیز؛
ضمن عرض پوزش به منظور تاخیر در پاسخگویی به شما، به حضور مبارکتان می رسانم مطلب مورد سوال شما تایید و مراتب به نویسنده ی پست ارجاع داده شده است، لذا پس از بررسی منابع و رسیدن به پاسخی معتبر و قابل اتکا، مطلب درخواستی بلافاصله یه سمع و نظر سرکار علیه میرسد…
پیروز و موفق باشید…
روابط عمومی وبسایت علوم آزمایشگاهی پزشکی و بالینی

امیراکبری
Admin

عالی ، آفرین

ronak
Guest

خسته نباشی عزیزم عالی بود

mori
Guest

خسته نباشید متن خوب و اموزنده ای بود یه سوال برام به وجود اومد اونم اینکه ورتکس ینی چی؟ و سوپرناتانت چیه و از چی تشکیل شده…در حقیقت یه توضیحی میخوام که کل مطلب برام جابیوفته…ممنون و متشکر

روابط عمومی
Member

درود برشما…دیدگاه شما بررسی شد، سوالات شما پس از ارزیابی به صورت کامل پاسخ داده می شود.

روابط عمومی وبسایت علوم آزمایشگاهی پزشکی و بالینی

mori
Guest

مرسی سرعت عمل مدیر روابط عمومی سایت…دمتون گرم

pegah shirzadeh
Guest

خیلی عالی بودمهرنوش جان ممنون

سورین زادحیدر
Member

مهرنوش جان در اوج شروع کردی :)
آزمایش طولانی بود واقعا خسته نباشی
عکس کلاف DNA عالیه !

سجّاد علیا
Guest

kheili kamel o khoob bood. mamnoon

میلاد مسچی
Member

بسیار عالی و گویا…تبریک شروع فعالیتتون و ارزوی موفقیت روزافزون.

دنا شیرانی
Guest

Bah bah bah☺kheili ham khub o kamel
Ba tasavire gooya:)))!

مهدیس مختار
Guest

ممنون مهرنوش جان.
خوب بود.