آموزش وردپرس
خانه / گزارش کار / ویروس شناسی (گزارش کار ) / ارزيابي PCR با روش الكتروفورز

ارزيابي PCR با روش الكتروفورز

يكي از ساده ترين و مرسوم ترين روش هايي كه در ارزيابي PCRاستفاده ميشود الكتروفورز است .

طي جلسه ي پيش (PCR) يك  پرايمر اختصاصي را به نمونه اضافه كرديم تا به ژن هدف خود بچسبد و تكثير شود ، حال در اين جلسه با ارزيابي كيفيت PCR خود با روش الكتروفورز  ميخواهيم ببينيم آيا تكثير صورت گرفته است يا خير ؟( جواب به صورت كيفي گزارش ميشود )

اگر تكثير صورت گرفته باشد ( ژن بيماري باشد ) > جواب مثبت است

اگر تكثير صورت نگرفته باشد ( ژن بيماري نباشد ) يا PCR خوب انجام نشده باشد > جواب  منفي است

اختصاصيت اين روش را primer تعيين ميكند .

نحوه ي عملكرد الكتروفورز :

همان طور كه ميدانيد الكتروفورز حركت مولكول ها در ميدان الكتريكي است يعني هرچه ذره كوچكتر > حركت سريعتر و هرچه ذره بزرگتر > حركت كندتر است .

در محيط كار از ژل آگارز استفاده ميكنيم تا يك شبكه ي داراي خلل و فرج فراهم آوريم كه داراي چاهك هايي براي نمونه گذاري است . ما نيز نمونه هاي حاوي DNA را در اين چاهك ها ريختيم ، الكترود منفي نزديك محل نمونه گذاري و الكترود مثبت دور از منطقه نمونه گذاري است چون نمونه داراي بار منفي است . پس از برقراري ميدان الكتريكي با اعمال اختلاف پتانسيل در دو سوي اين شبكه مولكول هاي DNA بر اساس وزن مولكولي و بار منفي خود با سرعت هاي متفاوتي درون شبكه متخلخل شروع به حركت به سوي الكترود مثبت ميكنند و در اين ازمايش تك باند ايجاد ميكنند كه نشان از خوب بودن كيفيت PCR ما است . :)

براي ارزيابي وزن مولكولي و تعداد اسيد نوكلئيك قطعه از يك size marker بنام ladder استفاده مي كنيم . Ladder مخلوطي از قطعات DNA با اندازه هاي متفاوت است كه بعد از الكتروفورز از هم جدا ميشود ( كه در چاهك اول ريخته ميشود ) مثلا اگر از ladder 1000 bp استفاده كنيم بعد از الكتروفورز قطعات 1000,900,800,700,600 تاbp 100(بیس پر) از هم جدا شده و در فواصل مختلف قرار ميگيرند و در واقع معياري هستند تا وزن مولكولي باند تشكيل شده خود را حساب كنيم .

در پايان كار ژل را روي لامپ UV ميگذاريم تا هرجا باند داراي  DNA باشد درخشان و ديده شود ، براي محافظت خود از UV از دستگاه ژل داك ( Gel Doc)  استفاده كرده كه مجهز به ترانسلوميناتور ،  هود و فيلتر و يك محفظه ي جدا شده داراي لامپ UV و دوربين است .

نمونه اي كه ما استفاده كرديم چون ژن نوتروفيل انساني بود ، حتما بايد تك باندي ك حدود bp 300 است تشكيل شود.

اگر باندي تشكيل نشود > يعني PCR ما درست انجام نشده و خطا دارد و يا در بيماري ها نشان دهنده ي عدم وجود بيماري است.

حالت ديگري هم ممكن است پيش بيايد > زماني كه سرتاسر نمونه يك اسمير داريم ، اسمير زماني تشكيل ميشود كه پرايمر اختصاصي عمل نميكند و به جاهاي مختلف از DNA ميچسبد ، بدين ترتيب قطعات DNA با اندازه هاي مختلف داريم .

براي جلوگيري از تشكيل اسمير > تغيير دماي annealing و يا تغيير غلظت mgcl2 پيشنهاد ميشود .

مواد لازم :

  1. پودر آگارز > غلظت ( 2.5-1%) . معمولا 1% اما اگر قطعات خيلي كوچك باشند 2.5% استفاده ميشود . تهيه آن هم بسيار ساده است : پودر اگارز را با بافر مخلوط و حرارت داده و در قالب ريخته تا سرد شود .
  2. Loading Buffer > سوكروز 40% + بروموفنل بلو 25%                                                                                                     (سوكروز سبب سنگيني و ته نشيني نمونه در چاهك ميشود و بروموفنل بلو براي رنگ آميزي محلول به كار ميرود )
  3.    TBE Buffer > تريس + اسيد اوريك + EDTA                                                                                                                   ( تريس و اسيداوريك بافر را ميسازند و EDTA با حذف يونهاي مورد نياز انزيم هاي شكننده ي DNA از خورد شدن DNA جلوگيري ميكند )
  4. جريان الكتريكي > 120 ولت يا بالاتر
  5. اتاديوم برومايد > براي رنگ اميزي DNA كه بسيار رنگ خطرناك و سرطان زايي است و بايد ايمني لازم در كار با اين رنگ به عمل آيد ، اما ميتوان از رنگ هاي بي خطر ديگري همچون سايبرگرين يا سايبرسيف كه قابليت اتصال به DNA را دارند و در برابر نور UV درخشان ميشوند استفاده كرد .( اين رنگ ها را هنگام ساختن ژل به بافر اضافه ميكنيم)
  6. آب مقطر

و اما نكته ي آخر :  اين روش به صورت كیفی گزارش ميشود و براي به دست اوردن تعداد ويروس ها ميتوان از روش real time pcr استفاده كنيم .

3epg

2epg
نمونه حاوي DNA را با بروموفنل بلو خوب مخلوط كرده
1epg
نحوه ي نمونه گذاري در چاهك هاي الكتروفورز
4epg
دستگاه ژل داك
5epg
ستون حاوي چندين باند همان ladder است كه به عنوان size marker استفاده ميشود

اين نوشته ممكن است دارای اشکالات علمی و نوشتاری باشد.

26 like
Print Friendly, PDF & Email

درباره ی مهرنوش ادیب

مهرنوش ادیب
نویسنده بخش ویروس شناسی پزشکی نویسنده بخش پاتولوژی

2
سوال یا نظری دارید؟ بنوبسید

avatar
2 Comment threads
0 Thread replies
0 Followers
 
Most reacted comment
Hottest comment thread
2 Comment authors
امیراکبری(سرپرست - مدیر مسئول)دنا شیرانی Recent comment authors
  Subscribe  
newest oldest most voted
Notify of
امیراکبری
Admin

بسیار عالی
آفرین

دنا شیرانی
Guest
dena sh

Kheili khub bud adib jan khaste nabashi:*