آموزش وردپرس
خانه / گزارش کار / ایمونولوژی ( گزارش کار ) / شناسایی مولکول های CD و تست روزت

شناسایی مولکول های CD و تست روزت

مولکول های CD:(خوشه های تمایزی)

در سطح سلول ها گلیکوپروتئین هایی وجود دارد که نقش های بسیار مهمی در ارتباطات ببین سلولی، ارتباط سلول با بافت و ایفای نقش در مراحل تکامل دارند. این گلیکوپروتئین ها محدوده ی وسیعی از عملکرد ها را در سلول بر عهده می گیرند؛ بعضی از آن ها ممکن است یک گیرنده باشند، برخی در کمک به چسیبدن به بافت ها ایفای نقش می کنند، برخی متمایز می شوند و خصلتی از خود نشان می دهند، برخی نقش انتقال پیام را برعهده دارند و … این مولکول ها عملکرد بسیار گسترده ای دارند و در مباحث سلولی-مولکولی جایگاه ویژه ای دارند.

در اوایل شناسایی این مولکول ها، آنها را بر اساس عملکرد متفاوتشان نام گذاری می کردند.( مثلا: آنتی ژن عملکرد لنفوسیتی و…)

اما به تدریج با کشف سایر آنتی ژن ها و افزایش تعداد نام ها و سختی در حفظ و یادگیری این اسامی، آنها را در یک سیستم نام گذاری بین المللی با یک شماره و حروف CD نام گذاری کردند.

در مباحث ایمنی با این CDها ارتباط زیادی برقرار می کنیم.مولکول های CD در برخی از رده های سلولی به صورت اختصاصی بیان می شوند.

مثلا در بیماری HIV اختصاصاً در افراد میزان سلول های CD4 کاهش می یابد که این مورد ناشی از حمله ی این ویروس به لنفوسیت های T و تخریب آنها است.

روش شناسایی CDها استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال است.

آنتی بادی مونوکلونال یک آنتی بادی موشی است که به طور اختصاصی می تواند یک CD خاص را شناسایی کند. گستره ی بسیار زیادی از این آنتی بادی ها به صورت تجاری موجود است. معمولا این آنتی بادی ها به  دو روش فلوسایتومتری و بیدهای مغناطیسی  این امکان را به ما می دهد تا یک دسته ی خاصی از CD ها که واجد این مارکر هستند را شناسایی، جداسازی و حتی شمارش کنیم.

* در فلوسایتومتری اصولا به دنبال یک مارکر خاص میگردیم.(مثل CD4 و CD8). در این روش از آنتی بادی هایی استفاده می شود که این آنتی بادی ها برعلیه آن شاخص مورد نظر بوده و با ماده ی فلورسنت نشان دار هستند.

در این روش پس از مخلوط کردن نمونه با آنتی بادی، مخلوط را به دستگاه می دهیم و دستگاه سلول هایی که با این آنتی بادی نشان دار شده اند را شمارش می کند و حتی می تواند آنها را جداسازی کند.

این روش امروزه کاربرد بسیار زیادی دارد.

*بیدهای مغناطیسی در آزمایشگاه های تحقیقاتی مورد استفاده قرار می گیرد. این بید ها در مرکز دارای یک هسته فلزی هستند. آنتی بادی هدف را بر روی هسته فلزی متصل میکنیم و وقتی به یک مخلوط سلولی اضافه می شود فقط آن دسته از CDهایی که آنتی بادی هدف مربوط به آنها است به مرکز فلزی می چسبند و سپس می توان به کمک یک آهنربا آن ها را جداسازی کرد.

مبنای هر دو روش فوق الذکر آنتی بادی های مونوکلونال است. امروزه کاربرد این مولکول ها بیشتر شده و علاوه بر کلاس تحقیقاتی، در آزمایشگاه های بالینی هم مورد استفاده قرار می گیرد.

قبل از کشف و تولید آنتی بادی های مونوکلونال به صورت تجاری، راهکار های دیگری مورد استفاده بود که به طور محدود در جداسازی سلول ها کمک میکرد، این راهکار ها عمدتا مبتنی بر یک سری اطلاعات بود که به صورت تجربی به دست آمده بود. به صورت تجربی گلبول قرمز گوسفند توانایی اتصال به یک سری از سلول ها را در بافت خون انسان داشت که بعدها مشخص شد این سلول ها لنفوسیت های T هستند. زمانی که امکانات تحقیقاتی بالاتر رفت به صراحت معیّن شد که گلبول  قرمز گوسفند به مارکر CD2 در روی سلول ها میچسبد. CD2 مارکرهایی هستند که بر روی لنفوسیت های T، سلول های NK و تایموسیت ها (کمتر در خون مشاهده می شوند) قرار دارند.

سایر CD مارکرها نیز به همین روش ها مورد مطالعه قرار گرفت که به طور مثال خون موش به مارکر CD5(لنفوسیت B) اتصال می یابد. به این موضوعات بیشتر در کتاب های قدیمی پرداخته شده است اما امروزه این روش ها منسوخ شده و فقط جهت ایجاد تجربه در کاراموزان و دانشجویان مورد استفاده قرار می گیرد.

تعریف روزت:

اگر گلبول قرمز طی ارتباط با لنفوسیت T یا CD2 برای مدتی انکوبه شود گلبول های قرمز به لنفوسیت ها می چسبند و منظره ای شبیه به گل رز را ایجاد می کنند، که به آن روزت می گویند؛ هرچقدر زمان انکوباسیون ببیشتر باشد روزت کامل تر می شود.

 

*روش زیر مورد استفاده در آزمایشگاه های تشخیص طبی نیست و فقط جنبه ی آموزشی دارد.

وسایل مورد نیاز:

IMG-20150506-WA0048

روش کار:

در اولین مرحله؛ جداکردن لنفوسیت ها از خون بیمار باید انجام بپذیرد. راحت ترین راه استفاده از محلول هایی است که چگالی مشخص غلظتی فراهم می آورد. یکی از معروف ترین محلول هایی که استفاده می شود محلولی به نام فایکول است. چگالی محلول فایکول از آب مقطر بیشتر است و به نوعی انتخاب شده که امکان تفکیک سلول ها را در بافت خون بر اساس چگالی آنها فراهم می کند.

ابتدا  3cc خون بیمار حاوی ضد انعقاد را با 3cc بافر هنکس مخلوط میکنیم تا رقیق شود.مخلوط به دست امده را به طوری که وارد فایکول نشود به ارامی به آن اضافه می کنیم( با چسباندن پیپت پاستور به لوله ی آزمایش خون به آرامی به سمت فایکول میرود و به علت اختلاف چگالی روی فایکول شناور می شود).

IMG-20150506-WA0066

سپس مخلوط فوق را به مدت 30 دقیقه با 2000 دور سانتریفوژ میکنیم. مطابق شکل زیر سلول های سنگین تر( RBCها) رسوب میکنند و سایر سلول ها به ترتیب چگالی و وزن از هم جدا می شوند.

DSC_0096

 

لنفوسیت را با یک پیپت پاستور از محلول جدا می کنیم و برای تست های مختلف از جمله روزت استفاده میکنیم.

ممکن است در حین جداسازی لنفوسیت ها مقداری بافر هنکس (مایع رویی) و فایکول ( مایع زیر لنوسیت ها) همراه آن خارج شود. برای جداسازی و خالص کردن لنفوسیت باید آن را شستشو داد به این روش که لنفوسیت جدا شده را در لوله ی آزمایش ریخته و روی آن بافر PBS (یک بافر فسفاته است)می ریزیم، ده دقیقه سانتریفوژ کرده و سپس ،کل مایع رویی را تخلیه میکنیم، لنوفسیت ها همان رسوب انتهای لوله است که مورد استفاده قرار می گیرند.

در مرحله ی بعد روی لنفوسیت خالص 1cc بافر می ریزیم تا کمی رقیق شود.

برای آماده سازی خون گوسفند باید به این نکته توجه داشت که نمیتوان این خون را به طور مستقیم استفاده کرد و لازم است که قبل از استفاده مورد شستشو واقع شود.

DSC_0094

برای شستن خون گوسفند مقدار مورد نیاز از آن را داخل لوله می ریزیم؛ روی آن بافر PBS می ریزیم و ده دقیقه سانتریفوژ کرده و سپس مایع رویی را خالی میکنیم… این کار را حداقل 3 مرتبه باید انجام دهیم.

سپس از ته نشین ته لوله که حاوی RBC خون گوسفند می باشد یک سوسپانسیون %0.5 تولید می کنیم؛ به این صورت که 100 لاندا از RBC های ته لوله را بر میداریم و به آن 19.9cc بافر PBS اضافه میکنیم. که در نهایت یک سوسپانسیون %0.5 حاصل می شود.

در نهایت 0.5cc از لنفوسیت هایی که جدا کرده بودیم را با 0.5cc از سوسپانسیون مخلوط می کنیم و 5 دقیقه سانتریفوژ میکنیم.سپس حداقل به مدت 2-3 ساعت در یخچال انکوبه می کنیم؛پس از این مدت نمونه را روی لام ریخته و زیرمیکروسکوپ با عدسی 40* بررسی می کنیم.

IMG-20150507-WA0007 - Copy

*لازم به توضیح است که هر چقدر زمان انکوباسیون بیشتر باشئ روزت ها کامل تر می شوند به همین منظور پیشنهاد میشود نمونه یک شبانه روز در یخچال انکوبه شود.

*مطابق شکل فوق در روزت کامل به هر لنفوسیت حداقل 5 گلبول قرمز چسبیده است و در روزت ناقص این تعداد کمتر از 4 عدد است.

 

(این نوشته ممکن است دارای نواقص علمی و یا نوشتاری باشد)

13 like
Print Friendly, PDF & Email

درباره ی میلاد مسچی

میلاد مسچی
مدیر روابط عمومی نویسنده بخش ایمونولوژی نویسنده بخش باکتری شناسی

14
سوال یا نظری دارید؟ بنوبسید

avatar
8 Comment threads
6 Thread replies
0 Followers
 
Most reacted comment
Hottest comment thread
9 Comment authors
نیلوفرمحمدامیراکبری(سرپرست تیم - مدیر مسئول سایت)میلاد مسچیeebest8 Recent comment authors
  Subscribe  
newest oldest most voted
Notify of
نیلوفر
Guest
نیلوفر

میشه در مورد آزمایشها cd 56/ cd16/ cd19 هم توضیح بدین

محمد
Guest
محمد

سلام ممنون از سایت خوبتون

امیراکبری
Admin

بسیار عالی

eebest8
Guest
eebest8

Hey, thanks for the article.Much thanks again. Fantastic.

سجّاد علیا
Guest
Sajjad Olya

ممنونم آقای مسچی،بسیار کامل و با تصاویری گویا بود.

سورین زادحیدر
Member

خیلی کامل و مفید بود ممنون

Milad
Guest
Milad

خیلی خوب بود خسته نباشید کلیه ی گروه وتشکر ویژه ازمیلادمسچی باتشکر میلادجعفری.

مهدیس مختار
Member

ممنون از گزارش کاملتون آقای مسچی.