آموزش وردپرس
خانه / گزارش کار / ایمونولوژی ( گزارش کار ) / تست احیای NBT و تشخیص بیماری CGD

تست احیای NBT و تشخیص بیماری CGD

مکانیسم کشتن داخل سلولی:

نوتروفیل ها و ماکروفاژها وقتی یک ذره را می بلعند آنرا منهدم می کنند(می کشند).چندین مکانیسم برای کشتن عوامل بیگانه وجود دارد، که بسته این که در نوتروفیل یا ماکروفاژ مد نظر باشد این مکانیسم ها قوی تر یا ضعیف تر عمل می کنند.

از روش های متفاوت در این مکانیسم، به موارد زیر اشاره میکنیم:

1) معروف ترین روش بحث استفاده از آنزیم ها است؛ از این آنزیم ها می توان بهلیزوزوم، الاستاز،کلاژناز  و … اشاره کرد.

2) تولید NO

3) ایجاد رادیکال های اکسیژن: نوتروفیل و ماکروفاژی که عامل بیگانه را بلعیده در فاگوزوم خود رادیکال های اکسیزن تولید می کند و این رادیکال ها حمله کرده و باعث مرگ آن عامل می شود. پس می توان گفت مکانیسم ایجاد رادیکال های اکسیژن تحت تأثیر آنزیمی به نام اکسیداز فاگوسیتی صورت می گیرد.

*این آنزیم که در دیواره ی فاگوزوم فعالیت می کند با مصرف O2های محیطی و محلول و مصرف NADPH رادیکال های اکسیژن و سوپر اکسید تولید می کند. این فرایند انفجار تنفسی می گویند.

* این آنزیم چند زیرواحدی است.

رادیکال های اکسیژن بسیار فعال است و به هر عاملی که داخل نوتروفیل یا فاگوسیت وجود داشته باشد حمله کرده و آن را تخریب می کند.

*این مکانیسم در نوتروفیل ها قوی تر است و این روش کارایی بسیار بالایی دارد.

در یک نقص ژنتیکی وابسته به X ، اکسیداز فاگوسیتی عمل خود را به درستی انجام نمی دهد؛ در نتیجه فرایند انفجار تنفسی در نوتروفیل ها اتفاق نمی افتد. افرادی که چنین نقصی دارند مبتلا به بیماری CGD یا Chronic Granulomatose Disease (بیماری گرانولوماتوز مزمن) هستند.

* در 2/3 موارد این بیماری ناشی از نقص ژنتیکی وابسته به X است ولی در 1/3 این بیماری اوتوزومال مغلوب محسوب می شود.

در نمای کلی فرد به صورت ژنتیکی نقصی دارد که توانایی سنتز اکسیداز فاگوسیتی را ندارد در نتیجه رادیکال های اکسیژن تولید نمی کند و انفجار تنفسی رخ نمی دهد پس نوتروفیل های این افراد در برخورد با عوامل گرم مثبتِ کاتالاز مثبت(که معروف ترین آن ها استافیلوکوک است) توانایی دفاع ندارد و شخص به این عفونت ها حساس است. عوارض بیماری از کودکی در شخص معلوم می شود امّا عوارض ایجاد شده با حیات فرد در تضاد نیست(کشنده نیست) اما مشکلاتی را ایجاد می نماید.

به تدریج این عوارض شدیدتر می شود و مشکلاتی را برای این افراد به وجود می آورد؛که به شرح زیر است:

1) عفونت های خفیف و معمولی که به صورت شایع بین افراد جامعه وجود دارد( مثل:جوش صورت) در این افراد بهبودی سریع ندارد و این عفونت ها طولانی مدت می شود.

2)زخم های این افراد بهبودیِ طولانی مدتی دارد.

در حقیقت امر، وقتی یک عامل عفونی وارد بدن می شود اولین دسته از لکوسیت های مقاومت کننده در برابر آن، نوتروفیل ها هستند، که اگر موفق به از بین بردن بیماری شوند چرخه ی التهاب متوقف می شود و فرد بهبود می یابد، اما اگر به هر دلیلی موفق به از بین بردن التهاب نشود و یا التهاب طولانی گردد، سایرمقاومت کننده ها (ماکروفاژها،لنفوسیت ها و…) به محل حرکت می کنند و درمواردی ایجاد ضایعاتی به نام گرانولوماتوز می کند.

در مورد افراد مبتلا به CGD عفونت های خیلی خفیف که بر روی پوست بدن ظاهر می شود(جوش) نیز به جای بهبودی به یک ضایعه ی گرانولوماتوز تبدیل می شود. این افراد در صورتی که متوجه بیماری خود نباشند، بعد از عمل جراحی دچار مشکلات خیلی شدیدی می شوند و زخم های انها بهبود نمی یابد.

*افرادی که از بیماری خو مطلع اند با مراجعه به پزشک و دریافت اینترفرون گاما تحت کنترل قرار می گیرند. اینترفرون گاما با فعال سازی سایر مسیرهایِ مقابله عوامل خارجی،کمکاری نوتروفیل ها را در مکانیسم انفجار تنفسی جبران می کند.

NBT(نیترو بلو تترازولیوم):

اسم اصلی آزمایش، تست احیای NBT است اما به صورت *تست NBT* مرسوم است.

*NBT یک ماده ی شیمیایی زرد رنگ است.

مراحل کار:

نوتروفیل های شخص را جدا می کنیم به آن NBT اضافه می کنیم. به منظور تحریک عمل انفجار تنفسی به آن PMA نیز اضافه می شود.اگر NBT مثبت باشد انفجار تنفسی صورت می گیرد و رنگ از زرد به بنفش تغییر می کند تا جایی که می توان نوترفیل های پر از گرانول و بنفش رنگ را زیر میروسکوپ مشاهده کنیم.

*PMA یک لکتین است که به صورت پلی کلنال بوده و باعث فعال سازی نوتروفیل ها می گردد.

*اگر حجم خون مورد استفاده در آزمایش زیاد بود، Buffy Coat را از Holl Blood جدا می کنیم و آزمایش را روی Buffi Coat انجام می دهیم.

*در آزمایشNBT به علت شدت عمل انفجار تنفسی گاهاً نوتروفیل ها نیز، لیز می شوند که در این صورت در اطراف یک نوتروفیل بی شکل،گرانول های ابی رنگ نیز دیده می شود.

->انتظار می رود:

1)در افراد سالم بیش از 95% نوتروفیل ها در مکانیسم انفجار تنفسی شرکت کنند و با NBT تغییر رنگ بدهند.

2)در افراد بیمار کمتر از 5% نوتروفیل ها در مکانیسم انفجار تنفسی شرکت کنند که نشان از بیماری CGD است.

3)افراد بینابینی: این افراد عوارض بالینی ندارند یعنی CGD نیستند اما تنها در حدود 50% از نوتوفیل های آنها تغییر رنگ می دهد.

روش کار:

2 الی 3 قطره خون تازه بدون ضد انعقاد را برروی لام اسیدواش شده می ریزیم؛سپس با اپلیکاتور یک گستره تشکیل می دهیم

DSC_0125

 

DSC_0129 - Copy

سپس آن را در تانک مربوط به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه می کنیم.

DSC_0129

پس از گذشت مدت زمان فوق لام را با بافر PBS شستشو می دهیم تا لخته های ان خارج شود؛

IMG-20150513-WA0014

پس از خشک شدن لام روی آن محلول حاوی NBT_PMA می ریزیم( روش تهیه ی محلول در مقاله ای جداگانه توضیح داده می شود.)

IMG-20150513-WA0006

سپس 20دقیقه در 37 درجه ی سانتی گراد انکوبه می کنیم.پس از مدت فوق الذکر دوباره لام ها را با بافر PBS شستشو می دهیم

IMG-20150513-WA0004

پس از خشک شدن لام ها روی ان متانول می ریزیم و با گذشت یک دقیقه لام ها را با آب شستشو می دهیم. پس از خشک شدن، روی لام ها رنگ سافرانین می ریزیم و پس از گذشت 5 دقیقه لام را می شوییم

IMG-20150513-WA0008

زیر میکروسکوپ برای دیدن نوتروفیل ها با گرانول های آبی تیره بررسی می کنیم.

Untitled

 

(این نوشته ممکن است حاوی مشکلات علمی یا نوشتاری باشد.)

20 like
Print Friendly, PDF & Email

درباره ی میلاد مسچی

میلاد مسچی
مدیر روابط عمومی نویسنده بخش ایمونولوژی نویسنده بخش باکتری شناسی

5
سوال یا نظری دارید؟ بنوبسید

avatar
3 Comment threads
2 Thread replies
0 Followers
 
Most reacted comment
Hottest comment thread
4 Comment authors
م.باقریامیراکبری(سرپرست تیم - مدیر مسئول سایت)میلاد مسچیسجّاد علیا Recent comment authors
  Subscribe  
newest oldest most voted
Notify of
م.باقری
Guest
م.باقری

سلام.
لطفا در رابطه با تست های تکمیلی این تست نظیر فلوسایتومتری دی هیدرو رودامین(DHR) هم مطلب بگذارید.ممنونم.

امیراکبری
Admin

روان و کامل مثل همیشه

سجّاد علیا
Member

مثل همیشه عالی بود