آموزش وردپرس

cell culture

کشت سلول

کشت سلول اهداف زیادی می تواند داشته باشد از اهداف کوچک مثل بررسی تکثیر سلولی و بررسی سلول از نظر نیازهایش تا تولید آنتی بادی های مونوکلونال که بوسیله ی کشت سلول های هیبریدوما در آزمایشگاه صورت می گیرد.

در آزمایشگاه ویروس از کشت سلول برای بررسی (CPE (cytopathic effect استفاده می شود.

cytopathic effect چیست؟

گاهی تغییرات ساختاری در سلول های میزبان صورت می گیرد که به علت حمله ی ویروسی است. به طور مثال ویروس سرخک دارای این اثر است.

این تغییرات ممکن است لیز مستقیم سلول یعنی مرگ مستقیم سلول بوسیله ی ترکیدن غشا باشد یا مرگ بدون لیز یعنی برای مثال ممکن است ویروس در سنتز پروتئین در سلول میزبان تداخل ایجاد کند و این تداخل باعث عدم تولید پروتئین و در نهایت از بین رفتن سلول میزبان می شود.

بررسی cytopathic effect:

برای این کار ویروس مورد نظر را به سلول میزبان تلقیح کرده و بر اساس آزمایش طراحی شده این اثر را بررسی می کنند.

اتاق کشت

به علت اینکه در اتاق کشت با سلول هایی سروکار داریم که بسیار حساس اند مواردی را باید رعایت کنیم :

۱) اتاق کشت نباید در مسیری باشد که رفت و آمد زیاد است.

۲)اتاق نباید در نزدیکی بخش های عفونی مثل بخش میکروبی یا بخش نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی باشد.

۳)اتاق کشت معمولا دو درب دارد ،یک درب ورودی که به یک اتاقک برای تعویض لباس و روپوش (روپوش مخصوص اتاق کشت) باز میشود و درب اصلی برای ورود به محیط آزمایشگاه.

۴)شست و شوی دست ها به میزان کافی بعد از ورود به اتاقک و تعویض لباس

۵)پنجره های اتاق کشت باید همیشه بسته و از نوع ۲جداره باشد و همچنین از تهویه ی مناسب استفاده شود که ورود و خروج هوا زیاد صورت نگیرد .

۶)برای استریل کردن هوای اتاق از لامپ های UV استفاده شود (بهترین نوع این لامپ ها از نوع سقفی آنها است که بعد از اتمام کار به مدت یک شب overnight آن را روشن گذاشته و برای شروع کار ،لامپ را خاموش کرده و درب را باز گذاشته تا مولکول هایی که در هوا ایجاد شده اند از بین بروند.

۷)برای استریل کردن کف از مواد گندزا (ضدعفونی کننده)استفاده میشود که معمولا دکونکس بهترین حالت است که تقریبا هر ۲-۳ روز یکبار استفاده میشود.

۸)برای ضدعفونی کردن سطوح از الکل ‌70% که غشای باکتری را شسته ولی از بین نمیبرد استفاده میشود .

 

دستگاه ها و تجهیزات اتاق کشت :

1)مهم ترین دستگاه این اتاق هود لامینار است (تقریبا همه ی کار ها زیر هود انجام میگیرد )

هود مورد استفاده در اتاق کشت سلول class 2 است .

هود ذرات بزرگتر از 0.3µ را میگیرند .

برای کار با هود برای جلوگیری از آلودگی درب شیشه ای را به اندازه ای که دست ها وارد هود شوند باز می کنیم.

قبل از شروع کار ،هود حتما باید ضدعفونی شود و برای جلوگیری از آلودگی نباید آن را شلوغ کرده و فقط وسایل مورد نیاز را درون آن قرار دهیم.

2)میکروسکوپ invert: تفاوت آن با میکروسکوپ معمولی این است که برعکس آن نور از بالا وارد آن شده و عدسی ها در پایین قرار گرفته اند و برای بررسی شرایط سلول ها به کار می روند.

3)انکوباتور:سلول ها برای رشد به شرایط ایده آل مثل دمای optimum (اکثرا 28-37 درجه ) بنا بر نوع سلول که اکثرا سلول های جانوری 37 درجه است نیاز دارند. این انکوباتور ها مجهز به ‌co2 هستند یعنی گاهی ‌co2 تولید میکنند (عموما ‌5%) . انکوباتور های اختصاصی تر دارای ‌alarm هستند برای دما و تنظیم co2 که از حد مناسب بالاتر نرود .

مزیت بزرگ انکوباتور: به تنظیم ‌ph کمک میکند به این صورت که یون بیکربنات موجود در محیط با گاز co2 تولید شده توسط انکوباتور ترکیب شده و سیستم بافری قوی ایجاد میکند که ph محیط را نرمال میکند .

در کار با انکوباتور به این نکته توجه شود حرف زدن باعث ایجاد عفونت های باکتریایی و قارچی در سلول ها میشود که مسئول عفونت های قارچی خود فرد  operator است اما عفونت های باکتریایی میتواند به علت استفاده از دستگاه های آلوده هم باشد .

4)وسایل مورد نیاز برای استریل کردندستگاه اتوکلاو برای استریل کردن که دمای ۱۲۱درجه را ایجاد میکند و با استفاده از چسب های اتوکلاو (در صورت سیاه شدن )  مشخص میشود که وسایل استریل شده اند . دستگاه فور برای استریل وسایل شیشه ای استفاده میشود.

5)دستگاه تولید آب مقطر (آب دیونیزه ) که همراه فور و اتوکلاو بیرون اتاق کشت و یا داخل اتاق اما دور از بخش اصلی و در اتاقک قرار گیرد .

5) یخچال برای نگهداری محیط کشت و مواد فریزری

 

مواد مصرفی ( اغلب یک بار مصرف ) :

  1. فلاسک کشت سلولی که شرایط استریلی را برای رشد سلول ها فراهم میاورد، فلاسک ها بر اساس سطحی که دارند ممکن است 25cm² یا 75cm²  باشند. فلاسک ها اغلب دارای درب فیلتردار هستند( بهترین نوع انهاست ) که موجب کنترل تبادل co2 و مانع ورود باکتری ها و عامل عفونی میشود . فلاسک های ساده و بدون فیلتر را باید هنگام قرار دادن در انکوباتور ، درب آن را کمی شل کنیم تا ورود و خروج ‌co2 امکان پذیر باشد و هنگام خروج ،درب انکوباتور را کمی باز کرده و درب فلاسک را همانجا سفت میکنیم و سپس بیرون میاوریم تا مانع ورود هر گونه آلودگی به داخل آن شویم . همچنین طرز قرار گرفتن فلاسک در دست باید به صورت مایل باشد زیرا در حالت افقی ماندن مایع در ناحیه ی گردن فلاسک باعث آلودگی میشود ، البته به صورت مایل گرفتن به مدت طولانی هم صحیح نیست زیرا سلول ها نمیتوانند به خوبی تغذیه شوند و می میرند،   در نهایت سطح فلاسک را استریل کرده و زیر میکروسکوپ شرایط آن را بررسی میکنیم.
  2. پیپت : یک سری شیشه ای هستند برای کشیدن محیط کشت و هر گونه مایع ،که قابل شست وشو و استریل هستند و بعد از شست وشو و خشک کردن ، پنبه ای سر آن میگذارند تا هوایی که میکشد هوای استریلی باشد، یک سری هم از نوع پیپت پاستور شیشه ای یک بار مصرف هستند.

 محیط کشت : اصلی ترین بستری که برای فراهم آوردن شرایط لازم و رشد سلول ها استفاده میکنیم.

محیط کشت = محیط پایه + سیستم بافری +سرم + آنتی بیوتیک

محیط کشت های مختلفی داریم اما همه ی آنها حداقل اجزایی که باید داشته باشند عبارتند از :

ویتامین – پپتید – لیپید  -هورمون- نمک مثل mgcl2- قند – آمینو اسید همچنین حاوی یک سیستم بافری مناسب که اکثرا ¯HCO3 (بیکربنات )دارد به علاوه ی سرم FBS (سرم جنین گوساله) یا FCS (سرم جنین گاو) که در واقع ماده ی مغذی سرشار از مواد مناسبی برای رشد سلول است که باعث بهبود کشت میشود که اگر سلولی را بدون سرم در محیطی کشت دهیم مرگش قطعی است ، و در نهایت رنگ اضافه میکنیم که حالت معرف دارد و اغلب از فنول رد (phenol-Red) که معرف اسیدی یا قلیایی بودن است استفاده میشود .

‌PH نرمال = رنگ قرمز -نارنجی ⁄ در PH قلیایی = رنگ ارغوانی ⁄ PH اسیدی ( زمانی که مواد غذایی را مصرف کرده و مواد سمی خود را آزاد کرده که نشان دهنده تعویض محیط کشت است ) = رنگ زرد  میشود .

انواع محیط کشت : RPMI 1640 – MEM- DMEM که بر اساس نوع اسید امینه با هم متفاوتند .

گاهی  اوقات محیط کشت را میتوان بصورت محلول آماده خریداری کرد که استریل و فیلتر شده است و فق به ان FBS اضافه میکنیم ، اما اگر بخواهیم محیط کشت را خودمان تهیه کنیم باید از پودر استفاده کنیم و آن را به مقدار مورد نظر با آب مقطر مخلوط کرده و سرم FBS یا FCS به مقدار 5_20% اضافه کرده و در نهایت آنتی بیوتیک که مهم ترین آن ها‌ Pen strep ( پنی سیلین100 Au⁄ml + استرپتومایسین100 Mg⁄ml ) است .

همه ی این مواد به صورت استریل با هم مخلوط شده و آماده میشود برای فیلتر کردن با فیلترهای ‌0.2 برای جلوگیری از ورود میکروب .

 

نحوه ی کشت سلول :

در cell culture از cell line استفاده میکنیم یعنی از یک خط سلولی یا یک سری سلول که نامیرا هستند و از بافت توموری بدست می آیند استفاده میکنیم.

2-3 روز بعد از کشت سلول ، انرا زیر میکروسکوپ بررسی میکنیم :

  • از نظر میزان رشد که آیا کل سطح فلاسک را پر کرده یا خیر ؟
  • از نظر رنگ محیط کشت که آیا تغییر کرده یا نه ؟  مثلا گاهی ممکن است درب فلاسک خوب بسته نشود که سبب قلیایی شدن (ارغوانی) و مرگ سلولی میشود و یا آنقدر مواد غذایی را مصرف کرده که زرد شده است که در این صورت باید محیط کشت را تعویض کنیم .
  • از نظر آلودگی ، در حالت عادی باید محیط کشت شفاف باشد چون سلول ها نور را از خود عبور میدهند اما در صورت آلودگی باکتریایی در صورت تکان دادن ، حالت ابر مانند ( ‌cloudy) میشود و در صورت آلودگی قارچی ، بافت های قارچ دیده میشود .
  • از نظر حجم سلول ها ( میزان تکثیر ) که در صورت افزایش سلول ها  باید آن را پاساژ دهیم.

پاساژ دادن سلول ها یعنی چه ؟ یعنی حجم سلول ها آنقدر افزایش پیدا کرده که دیگر این فلاسک گنجایش آن سلول ها را ندارد و باید آنرا رقیق کرده و به دو فلاسک تقسیم کنیم .

 

اساسا در cell culture با دو نوع سلول کار داریم :

1.سلول های غیر وابسته به بستر :در حالت طبیعی بصورت سوسپانسیون هستند و به هیچ سطحی متصل نیستند ، سلول هایی که در گردش خون داریم مثل سلول های رده ی لنفوئیدی و مایلوئیدی . وقتی این سلول ها را کشت میدهیم هر بار که فلاسک را تکان دهیم ، سلول ها از جای خود بلند میشوند .

پاساژ دادن این سلول ها بصورتی است که با یک پیپتاژ ساده ، سوسپانسیون تک سلولی درست کرده و در لوله فایکول استریل ریخته میشود  و پس از سانتریفیوژ ، مایع رویی که محیط کشت کهنه است خارج کرده و محیط جدید فراهم میشود ، سپس شمارش انجام میشود و داخل فلاسک جدید میریزیم .

2.سلول های وابسته به بستر : سلول هایی که نیاز به یک محیطی دارند که شبیه ماتریکس خارج سلولی باشد که سیگنال هایی برای رشدشان دریافت کنند ، این سلول ها بصورت دوکی شکل به  کف فلاسک متصل میشوند.

اکثر سلول هایی که از بافت تومورهای جامد ‌(solid tumor) گرفته میشود از این نوع هستند

 

محیط کشتHELA که بصورت دوکی شکل به کف فلاسک متصل شده است

انواع سلول های وابسته به بستر :

cell line          cell origin          Tissue          Organism

vero                epithelial             kidney           monkey

BHK_21            fibroblast            kidney            Hamster

HEP_G2          epithelial             liver               Human

HELA                epithelial             servix             Human

 برای پاساژ دادن این سلول ها ، باید آنهارا از کف فلاسک جدا کنیم و بدین منظور از پروتئاز ( تریپسین ‌‌) استفاده میکنیم ، تریپسین پروتئین هایی که در اتصال به کف نقش دارند را میشکند و آنهارا آزاد میکند ، این پروتئین به تنهایی کار نمیکند و در بازار بصورت محلول  Trypsin_EDTA 25% فروخته میشود .

EDTA در محلول یون های فلزی را حذف میکند و سبب شلاته شدن سلول ها میشود ، سلول ها در نهایت با این ماده بصورت سوسپانسیون درمی ایند .

سلول های HELA که در اثر تریپسین از کف جدا شده و بصورت گرد درامده اند

 

پروتوکل آزمایش :

ما در این ازمایش سلول ‌Hela را کشت دادیم که از نوع وابسته به بستر است.

  1. ابتدا زیر هود محیط کشت را خالی کرده سپس با بافری که فاقد یون فلزی باشد یک بار شست وشو میدهیم مثل Hanks Buffer
  2. به ازای هر 25cm²  یک سیسی تریپسین میریزیم و به صورت افقی مخلوط میکنیم تا به تمام سطوح برسد .
  3. ‌۱-۲دقیقه در انکوباتور میگذاریم ( نه بیشتر نه کمتر چون پروتئاز آسیب میرساند به سلول ) ، بعد از انکوباتور سلول ها زیر میکروسکوپ از حالت دوکی درمی ایند و گرد میشوند چون از سطح جدا شدند .
  4. توسط یک محیط کشت حاوی fbs تریپسین را خنثی میکنیم
  5. سلول هارا توسط پیپت داخل فایکول ریخته و 5min سانتریفیوژ میکنیم
  6. مایع رویی خارج و محیط کشت جدید اضافه کرده
  7. شمارش سلولی با لام نئوبار که باید سلول مرده و زنده را تشخیص دهیم که با رنگ تریپان بلو این افتراق صورت میگیرد چون سلول های مرده این رنگ را به خود گرفته و سلول زنده شفاف است
  8. بعد از شمارش نمونه را رقیق کرده و به فلاسک جدید انتقال میدهیم.

 

 

مرحله ی شمارش سلولی ( سلول های شفاف زنده اند و سلول های آبی مرده

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

فلاسک محیط کشت در زیر میکروسکوپ invert

 

 

 

هود

 

این نوشته ممکن است دارای اشکالات علمی و نوشتاری باشد.

20 like
Print Friendly, PDF & Email

درباره ی مهرنوش ادیب

مهرنوش ادیب
نویسنده بخش ویروس شناسی پزشکی نویسنده بخش پاتولوژی

سوال یا نظری دارید؟ بنوبسید

17 نظر در مورد "cell culture"

avatar
  Subscribe  
newest oldest most voted
Notify of
امیر
Guest

سلام
با تشکر از مطلب مفیدی که گذاشتین

فقط یک اشتباه تایپی وجود داشت که اگر مقدور باشد تصحیحش بفرماییید
به جای فایکول ، فالکون نوشته شود درست تر است.

صفورا
Guest

با سلام و عرض تشکر ا
چرا برای شستشو سلولها از FBS استفاده نمیشود

سوزان
Guest

خیلی متشکر از نویسنده مطلب
دوستان خواننده لطفا توجه داشته باشید گاه برای یک کلمه از این مطلب باید کلی خواهش و تمنا کنید از کارشناس یا کسی که استاد، شما رو بش معرفی کرده و با جواب سربالای او در همان ابتدای کار کلی ضدحال بخورید
بازم ممنون و سپاسگزار از اشاعهمطلب علمی و مهمتر از همه کاربردی
دست به دست هم دهیم و با دانش و سعه صدر به اینجور آدمها بفهمونیم که یاد دادن لیاقت میخواهد که طبیعی است همه از آن برخوردار نیستند

فاطمه
Guest

با سلام و خسته نباشید
یه سوال داشتم.من با سلولهای سرطان مغز استخوان مدل KG1 کار میکنم یه مدته که وقتی سلول را دفریز میکنم روز بعد همه شان اپوپتوز شده و مرده اند نمیدانم علت چیست .خوشحال میشم راهنمایی کنید

نازنین
Guest

با سلام،ممنون از مطلب خوبتون.در اتاق کشتی که من در ان مشغولم تا کنون همه شرایط برای رشد سلولها مناسب بوده است اما مشکلی وجود دارد که از دیروز شکل سلولها گرد شده و بسیاری از آنها نیز مرده اند. این مشکل نه تنها برای من بلکه برای دیگر رده های سلولی موجود در انکوباتور هم رخ داده است. لطفا راهنمایی بفرمایید که مشکل از کجا ممکن است باشد. با سپاس فراوان

ستاره
Guest

سلام و خسته نباشید
عالی بود
از کدوم سای های معتبر و علمی میتونیم در مورد ویيگی های رده های سلولی اطلاعات بدست بیاریم؟

امیراکبری
Admin

بسیار عالی ، ممنون

آریان رجب پور
Guest

ممنونم از یک ترم همکاری و همراهی ،
متن کامل و روان بیشترین کمک را در یادگیری داشت .

سورین زادحیدر
Member

خسته نباشی مهرنوش خیلی خوب بود

دنا شیرانی
Guest

Vaghean khaste nabashi azizam,mamnoon

نازنین منفرد
Guest
نازنین منفرد

مرسی از اینکه انقدر خوب نوشتی واقعا جامع و کامل و مفید و…

میلاد مسچی
Member

خیلی عالی و جامع درود برشما….ممنون

mry.boubash
Guest

بسیار مفید.خسته نباشید…

هانیه آذری
Guest

بالاخره تموم شد ،خیلی خیلی خسته نباشی مرسی