آموزش وردپرس
خانه / گزارش کار / باکتری شناسی عملی / خانواده ی میکروکوکاسه

خانواده ی میکروکوکاسه

خانواده ی  میکروکوکاسه دارای شکل کوکسی یا کروی هستند.در این گروه کوکسی های گرم مثبت را داریم. این خانواده شامل دو جنس مهم استافیلوکوک و میکروکوک میشود. جنس استافیلوکوک دارای 3 گونه ی مهم از جمله استافیلوکوک اورئوس،استافیلوکوک ایپیدرمایتیس و استافیلوکوک ساپروفیتیکوس است.گونه ی ساپروفیتیکوس و اپیدرمایتیس جزء فلور نرمال هستند و گونه ی  اورئوس گونه ی پاتوژن یا بیماری زا است.(فلور نرمال مجموع ای از میکرو ارگانیسم هاست که به طور طبیعی با ما هم زیست هستند. در پوست،دهان،دستگاه تنفسی فوقانی،دستگاه گوارش و …وجود دارند. برخی از نواحی مانند ریه،مغز،اندام های داخلی،خون فاقد میکروارگانیسم هستند و حضور هر نوع میکروارگانیسمی در نواحی مذکور نشانی از بیماری است.در صورتی که جایگاه و یا تعداد فلور نرمال تغییر کند میتوانند بیماری زا شوند.)

استافیلوکوک ایپیدرمایتیس فلور نرمال پوست واستافیلوکوک ساپروفیتیکوس فلور نرمال واژن است.پس تنها گونه ی بیماری زا بین این 3 گونه استافیلوکوک اورئوس میباشد.این گونه میتواند بیماری هایی همچون استئومیلیت،کورک،مسمومیت های غذایی و … را سبب شود.اما در کسانی که به طور ممتد با این باکتری در تماس اند مانند پزشکان و پرستاران میتواند به عنوان فلور موقت در بینی حضور داشته باشد.

زمانی که نمونه به دست ما میرسد اولین قدم تهیه ی اسمیر و رنگ آمیزی گرم است.رنگ آمیزی گرم 3 دسته اطلاعات به ما میدهد:

1-گرم مثبت است یا گرم منفی

2-شکل باکتری : کوکسی،میله ای و….

3-آرایش باکتری:تکی،دوتایی(دیپلو)،زنجیره ای(استرپتو)،چهارتایی (تتراد)،خوشه ای(استافیلو)

این سه خصوصیت تا سطح جنس را برای ما مشخص میکند.

فرض کنید فردی مسمویت غذایی دارد.نمونه ای که در اختیارمان است را رنگ آمیزی گرم میکنیم.نتیجه میشود : گرم مثبت(زیر میکروسکوپ به رنگ بنفش به دلیل جذب کریستال ویوله)،کوکسی شکل با آرایش خوشه انگوری.نتیجه میگیریم که از جنس استافیلوکوک است.برای مشخص کردن گونه از مجموعه تست های همان خانواده استفاده میکنیم.زیرا همه ی میکروارگانیسم ها با یک مجموعه تست مشترک مشخص نمی شوند.بر اساس توانایی های مختلف میکروارگانیسم ها تست های مختلف طراحی میکنیم.

برای خانواده ی میکروکوکاسه مجموعه تست های زیر را داریم :

کاتالاز،کوآگولاز،DNAse،حساسیت به آنتی بیوتیک باسیتراسین و نووبیوسین و کشت روی محیط مانیتول سالت آگار

1-کاتالاز:باعث تمایز بین خانواده ی میکروکوکاسه و استرپتوکوکاسه میشود.تمامی باکتری های موجود در خانواده ی میکروکوکاسه کاتالاز مثبت و تمامی باکتری های موجود در خانواده ی استرپتوکوکاسه کاتالاز منفی اند.

اساس تست کاتالاز: باکتری ها در غشای خود دارای زنجیره ی انتقال الکترون هستند که شامل یک سری ناقلین الکترون است.بر اساس دست به دست کردن الکترون انرژی موجود در الکترون را جمع کرده و به شکل دیگری از انرژی به نام ATP تبدیل میکند که برای میکروارگانیسم قابل مصرف است.نهایتا این الکترونی که انرژی خود را از دست داده است به اکسیژن میرسد.اکسیژن با پذیرفتن الکترون تبدیل به H2O2 (پراکسید هیدروژن)میشود.

H2O2 ماده ای سمی است که باعث تخریب غشای میکروارگانیسم میشود.طبیعتا میکروارگانیسم برای ایجاد ATP از طرفی دیگر به غشای خود آسیب نمیرساند و این پراکسید هیدروژن را با آنزیم کاتالاز خود به آب و اکسیژن تبدیل میکند.

نحوه ی طراحی آزمون کاتالاز : از باکتری نمونه میگیریم یا رو ی محیط کشت چند قطره H2O2 اضافه میکنیم اگر باکتری کاتالاز داشته باشد H202 تبدیل به آب و اکسژن میشود و حباب های اکسیژن را میبینیم—-> کاتالاز مثبت و اگرهیچ اتفاقی نیفتد —-> کاتالاز منفی

2-کوآگولاز:باعث افتراق گونه ی پاتوژن از غیر پاتوژن میشود.باکتری ها برای بیماری زایی نیاز به Virulence Factor یا فاتور بیماری زایی دارند.هرچه فاکتور بیماری زایی قوی تر قدرت بیماری زایی بیشتر.این فاکتورها میتوانند توکسین و اگزوآنزیم(آنزیم ترشحی) و … باشند.یکی از این آنزیم ها کوآگولاز است.کوآگولاز در گونه های بیماری زای استافیاوکوک ها وجود دارد  که به آن ،آنزیم لخته کنندگی میگویند.به فیبرینوژن ها که محلول هستند متصل میشود و آن ها را به رشته های فیبرین غیر محلول تبدیل مبکند و باعث ایجاد لخته میشود.این لخته اطراف میکرو ارگانیسم را گرفته و باعث میشود سیستم ایمنی میزبان به آن میکروارگانیسم واکنش نشان ندهد.پس کوآگولاز به باکتری قابلیت بیماری زایی میدهد.بنابراین در  اورئوس وجود دراد.

نحوه ی طراحی آزمون کوآگولاز: از پلاسمای سیتراته ی خرگوش استفاده میکنیم که دارای فیبرینوژن است.داخل این پلاسما ماده ی ضدانعقاد میریزیم مانند سیترات سدیم یا EDTA که شرایط محیطی سبب ایجاد لخته نشده و اگر لختگی مشاهده شد مطمئن باشیم که باکتری آن را ایجاد کرده است نه شرایط محیط. در مرحله ی بعد باکتری را کشت داده و داخل انکوباتور میگذاریم بعد از 30 دقیقه آن را بیرون می آوریم و در صورت وجود کواگولاز لخته مشاهده میکنیم.گاهی آنقدر میزان کواگولاز بالاست که محیط از حالت مایع به نیمه جامد تبدیل میشود.اگر بعد از این 30 دقیقه لختگی دیدیم مثبت گزارش میکنیم اگر نه دوباره به مدت 24 ساعت در انکوباتور قرار میدهیم.اگر لختگی دیده شد مثبت و در غیر این صورت منفی گزارش میکنیم.

تصویر نتیجه:

کوآگولاز

نکته ای که در مورد تست کواگولاز وجود دارد این است که پس از 24 ساعت نمی توان تشخیص صحیح داد زیرا بعد از مدّتی باکتری آنزیمی به نام فیبرینولایتیک تولید می کند و فیبرین را لیز میکند لذا لختگی نمیبینیم و ارزش تشخیصی ندارد و باعث منفی کاذب میشود.پس باید تا 24 ساعت بررسی شود.

نحوه ی انجام آزمایش: لوپ را استریل کرده ، نمونه برداشته و در محیط مایع حل میکنیم.(دهانه ی لوله نیز باید شعله پاش شود.)لوپ را به دیواره های لوله میزنیم تا نمونه کامل منتقل شود.انکوباسیون در 37 درجه

3-DNAse:اگزوآنزیمی مثل کوآگولاز است و قابلیت بیماری زایی به باکتری می دهد پس در استافیلوکوک اورئوس وجود دارد.این آنزیم DNA میزبان را دپلیمریزه میکند.DNA موجود در چرک و التهاب را لیز میکند و کمک به ایجاد جریان سیال میکند تا انتشارش در بدن راحت تر شود.

نحوه ی طراحی آزمون DNAse :باکتری را روی محیط DNA آگار کشت میدهیم.اگر باکتر ی همزمان با کشت، این آنزیم را ترشح کند وارد محیط کشت می شود و وقتی معرف میریزیم دور باکتری هاله ی شفاف تشکیل میشود یعنی باکتری آنزیم DNAse را ترشح کرده و DNA موجود در محیط را لیز میکند و ما هاله ی شفاف میبینیم.

این تست می تواند پاتوژن بودن یا نبودن را مشخص کند.

نحوه ی انجام آزمایش : برای این تست محیط DNA آگار داریم.ابتدا لوپ را استریل میکنیم.کنار شعله خنک میکنیم و در قسمتی از محیط کشت که کشتی داده نشده امتحان میکنیم.زیرا اگر لوپ داغ باشد میکروارگانیسم ها میمیرند و میکروارگانیسم مرده وارد محیط کشت میکنیم.

با اشاره ای توسط لوپ از باکتری برداشته  و در ادامه لوپ را به صورت یک خط روی محیط کشت میکشیم.این خط را ضخیم نمیکنیم زیرا در صورت تشکیل هاله تشخیص آن مشکل تر خواهدبود.

پلیت را به مدت 18-24 ساعت انکوبه کرده و سپس از لحاظ ایجاد هاله بررسی میکنیم.

دی ان ایز

تصویر نتیجه:

دی ان ایز

دی ان ایز

4-استفاده از باسیتراسین و نووبیوسین : در اینجا به منظور آنتی بیوگرام از این آنتی بیوتیک ها استفاده نمی کنیم.در واقع در اینجا برای تشخیص باکتری از آنتی بیوتیک ها استفاده میشود و نه کمک به انتخاب درمان دارویی مناسب.

میکروکوک ها نسبت به باسیتراسین حساس و استافیلوکوک ها  مقاوم اند.——> تمایز بین دو جنس

استافیلوکوک ایپیدرمایتیس و استافیلوکوک اورئوس نسبت به نووبیوسین حساس اند ولی ساپروفیتیکوس نسبت به آن مقاوم است.—–> تمایز بین گونه ها

نحوه ی انجام آزمایش: با همان روش معمول توسط لوپ نمونه برمیداریم.منطقه فرضی 1 را کشت متراکم میدهیم(این قسمت را وسیع کشت میدهیم زیرا میخواهیم دیسک های آنتی بیوتیک را روی آن قرار دهیم و باید در جایی گذاشته شوند که تراکم باکتری وجود داشته باشد.)

bac5

در مرحله ی بعد لوپ را می سوزانیم. هدف از انجام این کار این است که مرحله به مرحله تعداد میکروارگانیسم ها را کاهش دهیم تا به کلنی تک برسیم. پس از خنک شدن لوپ از منطقه 1 فرضی نمونه میگیریم.به صورتی که یک الی 2 بار داخل منطقه میرویم و مابقی را متراکم کشت میدهیم و دیگر وارد منطقه ی 1 نمیشویم.

دوباره را لوپ را استریل میکنیم و برای مرحله 2 به 3 به روش مرحله ی 1 به 2 کار میکنیم.

برای مرحله ی 3 به 4 لوپ را نمیسوزانیم.از منطقه ی 3 نمونه گرفته و به صورت زیگزاگی در منطقه ی 4 کشت میدهیم.(نباید به منطقه ی 1 و 2 برخورد کند که تراکم آن ها در این منطقه ایجاد نشود.)اگر فضای خالی داشتیم میتوانیم به صورت نقطه ای نیز کشت دهیم که در صورت وجود به صورت تک کلون دیده شود.

bac4

حال پنس را استریل کرده و از دیسک های نووبیوسین و باسیتراسین برمی داریم و در منطقه ی 1 که متراکم است قرار میدهیم.جهت تشخیص هاله دیسک ها باید با فاصله از لبه های پلیت و با فاصله از هم قرار داده شوند.

bac2

5-کشت روی محیط مانیتول سالت آگار: این محیط،یک محیط انتخابی افتراقی است.انتخابی یعنی به واسطه ی وجود ترکیبی که به عنوان ماده ی INHIBITOR عمل می کند قابلیت این را دارد که انتخاب کند یک گروه رشد کنند و گروهی دیگر روی آن محیط کشت رشد نکنند.برای مثال در محیط مانیتول سالت آگار نمک 7/5 درصد ماده ی inhibitor یا انتخابی است زیرا تمام میکروارگانیسم ها نمی توانند در درصد نمک بالا رشد کنند.باکتری هایی مثل جنس استافیلوکوک، میکروکوک و انتروکوک میتوانند در این محیط رشد کنند.

محیط های افتراقی باعث افتراق دو گروه میکروارگانسم براسا س ویژگی خاصی میشود.برای مثال در محیط مذکور ماده افتراقی قند مانیتول است.

همیشه حاصل تخمیر قند فارغ از نوع آن ،محصولات اسیدی هستند. PH محیط ها در حالت عادی به صورت خنثی است وقتی محصول اسیدی ایجاد میشود PH پایین می آید.در اینجا از معرف فنول رد برای تشخیص PH استفاده میکنیم که در PH اسیدی زرد و در PH قلیایی صورتی تا قرمز است.پس اگر باکتری قند مانیتول را تخمیر کند محصولات اسیدی ایجاد میشود و رنگ محیط زرد میشود.بنابراین براساس رنگ محیط میتوان بین میکروارگانیسم هایی که قند را تخمیر میکنند و آن هایی که تخمیر نمیکنند افتراق ایجاد کرد.

نحوه ی انجام آزمایش:محیط مانیتول سالت آگار را هم میتوان در لوله و هم در پلیت استفاده کرد.در اینجا ما محیط شیب دار داریم و برای کشت به جای لوپ از آنس سر سوزنی استفاده میکنیم.آنس را استریل کرده،نمونه را با حالت اریب برمیداریم(آگار صدمه نبیند.)سپس آنس را وارد محیط کشت میکنیم اما تا انتها نمی بریم.در همان راستا آنس را خارج کرده و روی محیط به صورت زیگزاگی پخش میکنیم.انکوباسیون در 37 درجه

bac6

bac3

تصویر نتیجه:

مانبتول سالت آگار


استافیلوکوک علاوه بر ویژگی های بالا امکان تولید پیگمان های طلایی ، لیمویی و سفید را دارد و دارای آلفا توکسین و همولیزین(نوعی توکسین) است که قابلیت لیز کردن گلبول های قرمز را دارد که به باکتری قابلیت ویرولانس را میدهد.

×سوال : چرا نمیتوانیم با انجام یکی از این تست ها نتیجه را گزارش کنیم ؟ برای مثال کوآگولاز و یا DNAse فقط در گونه های بیماریزا مثبت است پس   میت وان با انجام یکی از آن ها تشخیص داد.

×جواب : همیشه با مجموعه ای از تست ها جواب را گزارش میکنیم تا بتوانیم خطای کار را به حداقل برسانیم.

فرض کنید تمام مجموعه تست بالا را انجام دهیم و نتیجه به صورت زیر باشد :

کاتالاز مثبت،DNAse مثبت،نسبت به باسیتراسین مقاوم و نسبت به نووبیوسین حساس،مانیتول مثبت —-> به استافیلوکوک اورئوس شک میکنیم. ولی با این حال کوآگولاز منفی است.در این صورت تست کوآگولاز را تکرار میکنیم زیرا احتمال خطا در آن دیده میشود.

درصورتی که در شرایط بالا  فقط تست کوآگولاز را انجام میدادیم و بر اساس مثبت و منفی بودن آن گزارش میکردیم ،اگر خطایی وجود داشت،مشخص نمیشد.

 در آزمایشگاه میکروب شناسی در مجاورت شعله کار میکنیم زیرا این شعله به عنوان عایق حرارتی عمل می کند و باعث میشود در هنگام کشت فقط میکروارگانیسمی که وارد محیط می کنیم ،وارد شود.زیرا در صورت وارد شدن هر میکرو ارگانیسم دیگری به دلیل غنی بودن  محیط های کشت ممکن است در آن ها رشد کرده و ایجاد آلودگی نماید.

44 like

Print Friendly, PDF & Email

درباره ی سورین زادحیدر

سورین زادحیدر
مدیر بخش خبری نویسنده بخش ویروس شناسی پزشکی

7
سوال یا نظری دارید؟ بنوبسید

avatar
6 Comment threads
1 Thread replies
0 Followers
 
Most reacted comment
Hottest comment thread
7 Comment authors
امیراکبری(سرپرست و مدیر مسئول تیم)رویا داودیانمهدیس مختارترانه رضائیمجتبی بهروزی Recent comment authors
  Subscribe  
newest oldest most voted
Notify of
امیراکبری
Admin

بسیار عالی ، سپاس

رویا داودیان
Guest
رویا داودیان

عزیزم عالی بود و کامل. ممنون

مهدیس مختار
Member

سورین جان بسیار عالی فقط ی نکته : استافیلوکوک ایپیدرمایتیس ==> استافیلوکوک اپیدرمایتیس
موفق باشی عزیزم

ترانه رضائی
Member

خیلی کامل و عالی سورین جان

مجتبی بهروزی
Member

Besiar awli va mofid…ba tashakor

روشنک داودیان
Member

خیلی عالی و کامل بود
ممنون