آموزش وردپرس
خانه / گزارش کار / پاتولوژی ( گزارش کار ) / ایمنوهیستوشیمی و ایمنوفلوروسانس در پاتولوژی

ایمنوهیستوشیمی و ایمنوفلوروسانس در پاتولوژی

ایمنوهیستوشیمی ;Immunohistochemistry

تشخیص بافتی به روش شیمیایی و واکنش ایمنی;

آنتی ژنی که detect می کنیم میتواند یک پروتئین(معمولا),مولکول چربی یا قند باشد.

آنتی بادی ما معمولا IgG است چون ساختمان مولکولی کاملتری دارد,اتصال ِآنتی ژن و آنتی بادی به روش قفل و  کلید (در هم جور شدن) انجام میشود.

آنتی بادی مورد استفاده یا مونوکلونال است;(که در محیط آزمایشگاه ساخته میشود و اختصاصی تر است ) و یا پلی کلونال;(که از حیوانات گرفته میشود).

آنتی بادی به یک آنزیم متصل است که این آنزیم بعد از واکنش تغییر رنگ را در  کروموژن مثل روش الایزا ایجاد می کند .

واکنش آنتی بادی با آنتی ژن یا مستقیم است یا غیرمستقیم که صورت ِغیر مستقیم ِ آن اختصاصی تر است زیرا واکنش های اضافی را بیشتر حذف می کند. به این ترتیب که وقتی آنتی بادی اول اتصال می یابد آنتی بادی دوم به آنتی بادی اول وصل میشود یا حتی سوم به این مجموعه;و این فرایند واکنش را اختصاصی تر میکند و آنتی بادی های غیراختصاصی حذف میشود .

آنزیم مورد استفاده معمولا پراکسیداز و در وحله بعدی آلکالان فسفاتاز ممکن است باشد.

کروموژن ِمصرفی: دی آمینوبنزدین تتراهیدروکلراید است که رنگ قهوه ای ایجاد میکند,یا فرمی از طلا;طلای کلوئیدال که رنگ زرد ایجاد میکند امّا وقتی با نقره آن را تثبیت میکنیم رنگ قهوه ای ایجاد میشود

هماتوکسیلین(بنفش رنگ است) شاخص تر است و برای رنگ زمینه ای استفاده میشود,رنگ بنفش از رنگ قرمز و صورتی(-ائوزین) واضح تر و متمایز تر از رنگ قهوه ای می باشد
آنتی ژن هایی که ما باید شناسایی کنیم همیشه در سطح سلولها قرار ندارندو بایستیبازیافت یا رتریوال یا uncover شوند,در واقع پروتئین هایی که در سطح سلول است,چربی هایی که در سطح غشا یا عمق سلول است  باید لیز شوند تا آنتی بادی موردنظر در معرض قرار گیرد.

این بازیافت به روش گرمایی یا آنزیمی انجام میگیرد;

در روش گرمایی:بایستی گرما همراه با رطوبت باشد تا بافت از خشک شدن مصون بماند,در گذشته از بخارپز استفاده میکردند و امروزه از ماکروویوی که همراه با حفظ رطوبت باشد استفاده میشود

در روش آنزیمی از آنزیم هایی استفاده میشود که پروتئین ها را لیز میکنند;مانند تریپسین1%(که عمدتا از همین آنزیم استفاده میشود),پپسین,کموتریپسین  بسته به آن آنتی ژن 40-60 دقیقه در معرض آن قرار میدهند تا آنتی ژن بازیافت شود.

کار دیگری که در بازیافت انجام میشود بلاک آنزیمی است;آنزیم پراکسیداز در بعضی بافت ها وجود دارد و ممکن است با پراکسیدازی که ما استفاده میکنیم یا کروموژن ,واکنش اضافی دهد و تداخل ایجاد کند ,باید بلاک شود و بعد از آن پراکسیدازی که همراه با کروموژن توسط ما اضافه میشود باید استفاده شود و بررسی شود.

برای blocking در پراکسیداز از H2o2 5% در متانول خالص استفاده میشود.

پراکسیداز در نوتروفیل ها (سلولهای التهابی) ، بافت های حاوی خون ، طهال ، کبد  و آلکالان فسفاتاز در مجاری صفراوی ، استخوان و روده است;اگر برای مثال در استخوان بخواهیم یک آنتی ژن را تشخیص دهیم بدلیل وجود آلکالان فسفاتاز در استخوان باید آلکالان فسفاتاز ِ بافتی بلاک شود همچنین اگر در کیت ما این آنزیم وجد داشت باید بلاک شود. این کار توسط لوامیزول یک میلی مول انجام می شود.

برای این کار لازم است حدود 30 دقیقه بافت در معرض ماده بلاک کندده قرار گیرد تا پراکسیداز و آلکالان فسفاتازی که در بافت هست بلاک شود .

بلاک دیگری که در بافت انجام میگیرد بلاک ایمنوگلوبین است که در بعضی موارد استفاده میشودانجام میگیرد;زمانیکه بافت مورد بررسی ما بافتی است که ایمنوگلوبین در آن زیاد است.

مثال:خون یا بافت لنفاوی   —>مثلا وقتی میخواهیم در این بافت لنفوم را تشخیص دهیم;که در این بافت ایمنوگلوبین زیاد است باید بوسیله ایمنوگلوبین غیر اختصاصی(شبیه انسانی نباشد) مثلا خوک بلاک ایمنوگلوبین در بافت انجام شود  ، ایمنوگلوبین خوکی را میریزیم و بعد از آن آنتی بادی اختصاصی

فیکس شدن بافت در ایمونوهیستوشیمی باید با استون باشد ، در صورت عدم امکان استفاده از استون به ناچار می توان از فرمالین و بلوک پارافین استفاده نمود با ذکر این نکته که در اینصورت نمونه باید ظرف یک الی دو هفته اوّل بررسی شود تا صحّت داشته باشد.

آنتی بادی ها باید در غلظت های متفاوتی ریخته شود . دلیل آن هم این میباشد که در نمودار زنگوله ای شکل واکنش آنتی ژن – آنتی بادی ببینیم بیشترین واکنش در چه غلظتی اتفاق می افتد و از وجود یا عدم وجود آنتی ژن و همچنین میزان آن اطلاع پیدا کنیم.

اگر غیرمستقیم باشد بعد از آن آنتی بادی دوم را میریزیم ,کروموژن رنگ ایجاد میکند(آنتی بادی دوم  اختصاصی تر است و واکنش بیشتری ایجاد میکند)

بعد از این مرحله رنگ باید رنگ اضافی را بشوییم

تریس بافر سالین ماده ای که استفاده از آن برای شستشوی رنگ در آزمایشگاه رایج است.

_استفاده های ایمنوهیستوشیمی:

از این تکنیک ، هم برای تشخیص استفاده میشود و هم درمان

در نئوپلاژی ،  سلولهای توموری یا مشابه بافت اولیه اند یعنی خیلی تمایز یافته اند و یا ممکن است تمایز کمی داشته باشند و یا تمایز نیافته باشند(شبیه نباشند) اگر یک توموری تمایز پیدا نکرده باشد معمولا تومور بدتری است یعنی سلول ها انقدر سرعت تکثیرشان بالاست که فرصت اینکه شکل بالغ خودشان را پیدا کنند نداشته اند در این صورت ما نوع بافت را در روش های میکروسکوپی نمیتوانیم تشخیص دهیم که مثلا آیا بافت لنفاوی یا عضلانی و یا پوششی است که هر کدام نیز درمان متفاوتی دارند و از نظر جراحی و رادیوتراپی  تشخیص ِاینکه یک تومور بدخیم است نمی تواند کافی باشد.

روش ایمنوهیستوشیمی آنتی ژن های دوران جنینی را که در آن وجود دارند را شناسایی میکند برای مثال تومور اصلا شکل عضله را ندارد ولی پروتئین اکتین و میوزین را دارد —>نشانه این است که تومور مربوطه عضله است  رنگ آمیزی ما برای آنتی ژن اکتین یا میوزین است . یا وجود CD10 در تومور تمایز نیافته لنفاوی.


برای درمان;
برای درمان تومور های پستان که شایع ترین تومور بدخیم پستان که در 10% خانم ها دیده میشود.  شایع ترین آن تومور مجاری پستان است. در سطح این سلول های بدخیم گیرنده استروژن یا گیرنده پروژسترون دارند که این گیرنده ها بر روی سلولهای تومورال مثبت است اگر این گیرنده ها مثبت باشد پیش آهگی تومور بهتر است و به درمانهای هورمونی بهتر پاسخ میدهد
آموکسیفن یک داروی هورمونی است که میتواند برای آندومتر عوارض داشته باشد پس زمانی استفاده میشود که بدانیم ER و PR مثبت است و تشخیص مثبت بودن این دو نیز بوسیله ایمنوهیستوشیمی صورت میگیرد; آنتی بادی برعلیه گیرنده استروژن و پروژسترون را با این سلول مجاور کنیم تا ببینیم واکنش چگونه است
هرتو(Her2)  یک آنتی ژن بر روی سلولهای تومور پستان که وجودش نشانگر پیش آگهی بدتر و تکثیر بیشتر سلولهای پستان است ، prognos بدتر است و در صورت وجود آن بایستی ازین دارو استفاده کرد  ،  هرسپتین داروی درمان این نوع تومور است ، امّا استفاده از دوره کامل هرسپتین بسیار گرانقیمت است ( در حال حاضر حدود 50 میلیون تومان ) پس تشخیص صحیح به منظور جلوگیری از اتلاف هزینه و حفظ سلامت شخص بسیار مهم است.

ایمنوفلورسانس ;Immunofluorescence:

روش دیگری که در آن آنتی بادی به ماده فلورسین متصل شده است.

این آنتی بادی وقتی در مقابل اشعه UV یا نور آبی در اتاق قرار بگیرد در زیر میکروسکوپ فلورسنس تشعشع سبز سیبی”apple green می دهد,آنتی بادی مورد استفاده معمولا IgG است که به فلورسین متصل میشود.

در این روش بهترین حالت آن است که بافت با استون فیکس گردد,در صورت نبود آن اتانول 70 درصد و در صورت نبود آن ، فرمالین نیز قابل قبول استولی کیفیت آن پایین تر میباشد

امّا باید قبل از دو هفته به دست ما برسد.

**فرمالین مناسب برای استفاده: 10% است که آن را از فرمالین خالص37% میسازیم

مدت زمانی که بلوک پارافینی بدست ما می رسد حدود 2هفته میباشد.

پس بافت تازه یا بافتی که نگهداری شده برش میخورد و حدود یک ساعت آنتی بادی متصل به فلورسین روی آن روی لام قرار میدهند .

  برای شستشوی آنتی بادی اضافی ، فسفات بافر سالین به مدت ده دقیقه استفاده می شود, و بعد زیر میکروسکوپ فلورسانس میبینیم,چنانچه در همان موقع تصمیم به دیدن آن نداشتیم میتوانیم از پلی ونیل الکل روی لام استفاده کرد ,و بعد از آن تا یک سال در 4درجه سانتیگراد (دمای یخچال,به دور از نور) نگهداری کنیم تا فلورسین از بین نرود.

کاربرد ایمنوفلورسانس

آنتی نوکلئار آنتی بادی:(ANA)

    آنتی بادی ضد هسته در بیماری انسانی بیشتر از سایر آنتی بادی ها مثبت میشود . در بیماری انسانی لوپوس 90 درصد مثبت  است لذا در مورد این بیماری تستی حسّاس به شمار می رود امّا اختصاصی نیست چرا که در  بیماری های دیگری (بیماری های روماتولوژی و…) این آنتی بادی مثبت است از جمله رماتیسم مفصلی و نیز در   و “شگرن” (بیماری غدد بزاغی و غدد ترشحی مثل اشک …) مثبت میشود و نیز در اسکرودرمی

پس این تست برای لوپوس حساس میباشد ولی بایستی توجه داشت در صورت مثبت بودن نمیتوان به قطعیت ابتلا به لوپوس را تایید کرد چراکه احتمال دارد فرد به سایر بیماری های ذکر شده مبتلا باشد

 (آنتی بادی علیه دابل استرندد دی.ان.ای  (آنتی دی ان ای

 تقربا برای لوپوس اختصاصی میباشد ولی در 30% موارد مثبت میشود

آنتی اس ام نیز در لوپوس در سی درصد موارد مثبت می شود. اس ام یک پروتئین هسته ای است و تقریبا برای لوپوس اختصاصی است.

به این معنی که اگر نتیجه مثبت شود تقریبا میتوان به وجود لوپوس پی برد ولی در صورت منفی شدن نمیتوان این بیماری را رد کرد

ANA positive و AntiDNA negative پس با توجه به گفته های فوق در صورتیکه فرضا شخص

باشد نمیتوان در مورد ابتلای به لوپوس یا عدم ابتلا با قطعیت نظر داد

به طور کل اگر نتیجه یک تست حساس مثبت و نتیجه یک تست اختصاصی منفی باشد تشخیص ما با مشکل روبه

رو خواهد شد!

در این موارد از ایمنوفلورسانس استفاده میکنیم

برای ایمونوفلورسانس در هسته رنگ آمیزی می کنیم ، اگر واکنش در هسته منتشر بود ، تشخیص به نفع لوپوس دارویی است و معمولا با قطع دارو ، رفع می شود .آنتی بادی علیه هیستون است .

اگر رنگ گیری هسته به صورت منقوط بود ، تشخیص به نفع شگوگرن است.

اگر به صورت حاشیهای رنگ بگیرد (رینگ) به نفع لوپوس می باشد.

اگر هستک رنگ بگیرد به نفع اسکلرودرمی است

 

لوپوس یک بیماری سیستمیک می باشد که مفاصل ، مغز استخوان ، کبد و کلیه را درگیر می کند و مثل سایر بیماری های اتوایمن در خانم ها شایع تر می باشد .

اسکلرودرمی : پوست سخت می شود (اسکلروز) چین های پوستی از بین می رود.

همراه با این سخت شدن ، فیبروز در ریه ، مری ، بلع مشکل ، تنگی نفس و درگیری اعضای دیگر مثل کلیه و .. مشاهده می شود .

 

پس در مواردی که در شکاف تشخیصی هستیم می توانیم از ایمونوفلورسانس استفاده کنیم

بیماری های خودایمنی در زمینه ی عروق ; Vasculit ها : آنتی بادی علیه جدار رگ ساخته می شود ، نوتروفیل ها علیه این آنتی بادی واکنش می دهند و بعد آنتی بادی علیه نوتروفیل ها نیز در بدن ساخته می شود.

بیش از 30 عدد بیماری در این گروه قرار دارد . یکی از بیماری های شایع این دسته “وگنر” می باشد که عوارض زیادی دارد ; ریه را درگیر می کند ،عروق متوسطه را درگیر می کند و ونیز خوردگی تیغه بینی را سبب می شود.

در وگنر :

– ANCA مثبت است

آنکا c

( anti neutrophilic cytoplasmic anti body ) (منتشر در سیتوپلاسم است )

و آنکا P ( دور هسته است)

در صورتی که ANCA مثبت باشد سایر واسکولیت ها مطرح نیستند پس این آنزیم برای تشخیص وگنر در واسکولیت ها به کار می رود .

برای تشخیص بعضی از بیماری های پوستی مثل پمفیکوس یک خانواده از بیماری های پوستی (در این بیماری آنتی بادی علیه اجزای پوست ساخته میشود و جزء بیماری های پوستی نادر است و   به دلیل تاول هایی که باعث می شود آب بدن و پروتئین از دست برود مرگ آور می باشد )

جزءی که آنتی بادی علیه آن ساخته میشود میتواند لایه کراتین دانه دار,لایه بازال باشد و یا زیر لایه بازال

همه این موارد فرم متفاوتی از بیماری های خانواده پفیمپوس را ایجاد میکنند

باید توجه داشت که تشخیص و درمان بیماری در انواع مختلف پفیمپوس متفاوت میباشد

گاهی تشخیص دچار مشکل می شود و با چند بیماری پوستی تشخیص افتراقی آن دچار مشکل می شود

پس برای تشخیص بیماری که آیا از خانواده پفیمپوس میباشد و اگر بله کدام نوعِ آن,از ایمنوفلورسانس استفاده میکنیم و در واقع آنتی بادی بر علیه آنتی بادی ای میسازیم که در پوست ایجاد شده

[در این تکنیک برای حصول اطمینان از تشخیص,از کنترل مثبت و منفی نیز استفاده میکنیم] 10 like
Print Friendly, PDF & Email

درباره ی دنا شیرانی

دنا شیرانی
مدیر اسبق بخش هنری نویسنده سابق بخش پاتولوژی

سوال یا نظری دارید؟ بنوبسید

4 نظر در مورد "ایمنوهیستوشیمی و ایمنوفلوروسانس در پاتولوژی"

avatar
  Subscribe  
newest oldest most voted
Notify of
ali jafari
Guest

بسیار عالی و ممنون از زحمات شما

jahangir amirahmadi
Guest

با تشکر از زحمات بی مزد و منت دوستان عزیز عالی و کامل بود

روشنک داودیان
Member

خیلی ممنون خیلی خوب بود دنا جان.

مهرنوش ادیب
Guest

خیلی عالی بود خسته نباشی همکار